Nu is het biotechbedrijf Celyad op zoek naar een niet-gen-bewerkte aanpak om allogene CAR-T-cellen te maken met behulp van RNAi. Afgelopen oktober kondigde Celyad een samenwerking aan met shRNA-experts Dharmacon, een bedrijf van Horizon Discovery, om hun geoptimaliseerde shRNA-technologie te gebruiken om CAR-T-therapieën te creëren.
Om een ??succesvolle allogene CAR-T-therapie te maken, moet u ervoor zorgen dat de donor-CAR-T-cellen niet-specifiek reageren met de gezonde gastheercellen. Celyad gebruikt verschillende methoden, waaronder shRNA, om het T-celreceptor (TCR) -complex in T-cellen te vernietigen door de expressie van een bepaald eiwit in het complex CD3-zèta te blokkeren. Het TCR-complex bestaat uit acht eiwitten die samen op het T-celoppervlak zijn gegroepeerd en die belangrijk zijn voor de functie van een T-cel. Zonder het CD3-zeta-eiwit wordt het TCR-complex niet op de juiste wijze tot expressie gebracht op het T-celoppervlak en kan het signalen niet goed verzenden. Dit betekent dat de van donor afkomstige gemodificeerde T-cellen de eigen cellen van de gastheer niet mogen aanvallen, een complicatie die bekend staat als graft-versus-host-ziekte (GvHD).
Volgens Filippo Petti, CEO van Celyad, concentreert de meeste genbewerking zich op een andere component van het TCR-complex, de TCR-alfaketen. Hoewel shRNA kan worden gebruikt om meerdere componenten van het TCR-complex te elimineren, koos Celyad ervoor om zich te concentreren op het blokkeren van CD3-zeta-expressie omdat het de "snelheidsbeperkende stap" is in TCR-complexexpressie. Petti zei dat ze een TCR-complexdowndown bereikten met shRNA vergelijkbaar met dat met CRISPR / Cas9-gensuppressie.
Celyad ontwikkelt T-cellen om een ??CAR uit te drukken die de NKG2D-receptor bevat, die bepaalde stressmarkers herkent die tot overexpressie worden gebracht op vele soorten kankercellen. Aanvankelijk richtten zij zich op volwassen acute myeloïde leukemie (AML), myelodysplastisch syndroom (MDS) en multipel myeloom (MM).
Om alle benodigde componenten in de T-cellen te krijgen, gebruiken ze een alles-in-één-vector die codeert voor de CAR, shRNA en een tag die positieve selectie van cellen mogelijk maakt die beide componenten tot expressie brengen (de CAR en shRNA). Deze screeningsmethode is uniek omdat alleen negatieve selectie op gen-bewerkte CAR-T-cellen kan worden uitgevoerd om te verifiëren dat het gewenste gen is uitgeschakeld. Door zowel een positieve screening (via expressie van de vectorgecodeerde tag) als een negatief scherm (via TCR-complexdowndown) kan Celyad efficiënt de juiste CAR-T-cellen selecteren.
Het "SMARTvector" -platform werd ontwikkeld en geoptimaliseerd door Dharmacon, die natuurlijk voorkomend menselijk microRNA screende om een ??scaffold te selecteren die niet alleen efficiënte verwerking van het shRNA uit de vector en de expressie van alle vectorcomponenten mogelijk maakt, maar ook niet tot overexpressie brengt. het antisense shRNA, waardoor cellulaire toxiciteit wordt vermeden.
Hoe kunnen niet-genetisch bewerkte CAR-T-therapieën een verschil maken in de kliniek?
In muizen voorkwamen zowel gen-bewerkte als met shRNA gemodificeerde CAR-T-cellen belangrijk gewichtsverlies, een typisch kenmerk van GvHD, en vertoonden vergelijkbare overlevingspercentages.
Interessant genoeg bleven de CAR-T-cellen gemaakt met behulp van shRNA langer bestaan ??dan die gemaakt met CRISPR / Cas9. Petti veronderstelde dat, omdat shRNA geen strikte "aan-uit" -schakelaar is, shRNA-gemodificeerde T-cellen nog steeds een aantal TCR-complexsignalering mogelijk zouden maken. Dit zou ervoor zorgen dat de T-cellen "blij, persistent en replicerend zijn - de T-cellen zich als T-cellen gedragen", in plaats van het volledig afsluiten van signalering zoals gen-editing. Het is belangrijk op te merken dat voldoende TCR-complex signalering wordt uitgeschakeld om de kans op GvHD bij muizen te verkleinen.
Door deze langere persistentie (en potentieel langere duur van het effect) te koppelen aan een enkele all-in-one-vector en door de cellen die op de juiste manier worden uiten te selecteren, kunnen de door shRNA gemaakte CAR-T-cellen gemakkelijker en goedkoper worden geproduceerd dan het CRISPR-gen bewerkte CAR-T-cellen.
"ShRNA kan om twee redenen een disruptor zijn: met shRNA gemodificeerde CAR-T-cellen zijn persistenter dan gen-bewerkte CAR-T-cellen, wat mogelijk gunstig zou kunnen zijn in de kliniek en het feit dat shRNA een gevestigde geschiedenis heeft," vertelde Petti BIOSPACE. "RNAi bestaat ongeveer 20 jaar, het is geoptimaliseerd en er is al andere RNAi-technologie die wordt bestudeerd en beschikbaar is."
Celyad's CAR-T therapieën in ontwikkeling
Van hun hoofdkandidaat CYAD-01, een autologe CAR-T-therapie met hun NKG2D CAR-technologie, is al aangetoond dat ze goed wordt verdragen in lopende Fase 1/2 ( THINK ), Fase 1 ( DEPLETHINK ) en Fase 1 ( SHRINK ) -proeven voor de behandeling van zowel hematologische maligniteiten (AML, MDS en MM) als solide tumoren (colorectale, ovarium- en pancreaskanker).
Deze resultaten zijn positief, omdat Celyad andere CAR-T-therapieën ontwikkelt op basis van deze NKG2D CAR-technologie, zoals CYAD-101, een allogene CAR-T-therapie die hun TCR-remmende molecule (TIM) gebruikt om TCR-complexsignalering te onderbreken. TIM is een ingekorte vorm van het CD3-zeta-eiwit, die de TCR-complexsignalering verstoort. Het is een alternatieve benadering van shRNA die voorkomt dat donor-CAR-T-cellen reageren met de gastheercellen, waardoor uiteindelijk ongewenste ernstige bijwerkingen zoals GvHD worden voorkomen. CYAD-101 wordt momenteel bestudeerd in een open-label klinische fase 1-studie ( alloSHRINK ) voor 36 patiënten met gemetastaseerde colorectale kanker.
Celyad ontwikkelt ook de CYAD-200-reeks van nieuwe, niet-gen-bewerkte op shRNA gebaseerde CAR-T-therapieën. CYAD-200-therapieën worden gemaakt met behulp van de "SMARTvector" -technologie om een ??CAR- en shRNA-targeting van CD3-zeta tot expressie te brengen om het TCR-complex te elimineren.
Voor de 200-serie ontwikkelt Celyad drie eersteklas allogene niet-gen-bewerkte CAR-T-therapieën : CYAD-211 gericht op B-celrijpingantigeen (BCMA) om MM te behandelen (naar verwachting in de kliniek medio 2020) ; CYAD-221 gericht tegen CD19 om B-cel maligniteiten te behandelen (naar verwachting in de kliniek eind 2020); en CYAD-231 gericht tegen zowel NKG2D als een niet nader genoemd membraaneiwit voor de behandeling van een niet nader genoemde ziekte (verwacht dat deze begin 2021 in de kliniek zou terechtkomen).